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发布时间：2020-07-14 13:27 信息来源： 阅读次数： 次
根据治疗细胞的类型，我们大致可以分为免疫细胞和干细胞，如下图所示。
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CAR-T细胞治疗是一种以患者自身T细胞为基础的治疗，通过白细胞分离术收集患者的外周血单核细胞（PBMC细胞)，再分离出特定的T细胞亚群，如CD4+、CD8+、CD25+或CD62L+T细胞。分离出的T细胞起始亚群需要持续和充分的激活才能实现体外扩增，这就需要通过T细胞受体信号和CD28、4-1BB或OX40信号等共刺激信号产生主要的特异性信号，从而激活T细胞。再通过电穿孔、慢病毒或逆转录病毒载体，将CAR基因导入激活的T细胞中进行基因修饰，从而得到可表达CAR基因的CAR-T细胞（如下图所示为整个CAR-T生产的流程）。
曾有报道，作为两家CAR-T原研药生产厂家，诺华的Kymriah和Kite制药的Yescarta在早期CAR-T制备的失败率都比较高，而这些失败的原因中除了病人因为个体差异而导致失败外，制备得到的CAR-T细胞质量和数量也是很重要的因素。
3.1 T细胞刺激后体积监控的重要性
由Springer（施普林格科学）公司于2017发行，题为Methods in Molecular Biology - Acute Myeloid Leukemia - Methods and Protocols （分子生物学方法 -急性髓细胞白血病-方法和方案）的参考标准方法流程中，刊登了一篇名为Generating and Expanding Autologous Chimeric Antigen Receptor T Cells from Patients with Acute Myeloid Leukemia，的文章（如左下图），由几位著名的T细胞高手(Saad S. Kenderian, Carl H. June, 和 Saar Gill)编写的急性髓细胞白血病自体Car-T细胞的生成和扩增方法。
在3.1的＂从AML患者扩增T细胞＂过程，由刺激日起计的第3天，每隔1天要进行细胞计数，保持细胞在1x106细胞/mL。第6天磁珠转移后，也需要进行细胞计数。
除了细胞计数外，还要通过库尔特计数和粒度分析仪Multisizer来记录平均细胞体积（MCV），因MCV上升等于T细胞被激活，而在被激活后的第5-7天达到最大。然后随着T细胞开始休息而下降。当MCV变为300 fL（通常在第9-14天范围）时表明细胞得到了充分休息，可以进行后续的冷藏或测试（如右下图）。
通过监测T细胞的体积，比较不同CAR-T细胞及T细胞的平均体积差异，比较培养激活过程中的体积变化，帮助判断细胞何时到静息/稳定状态，另外帮助判断细胞的激活强度，为研究做出科学判断或决定下一步操作，如后期的功能检测或冷冻保存等。
那么为何库尔特法的Multisizer可以准确地给出T细胞激活后体积的变化值呢？这是因为库尔特法的原理，以及Multisizer配备了数字脉冲处理器（DPP），库尔特的原理是通过检测单个细胞通过小孔时电压的变化来精确记录，并且换算得到每个细胞的体积，而配备的数字脉冲处理器，可以使得检测的分辨率达到nm级别，所以可以对细胞体积的微小变化都能准确的记录下来。
另外，如果采用传统的显微镜或其他图像法仪器观察细胞体积的变化，不仅看到的是二维的图，并不能真正反映反映细胞整体真实的体积大小。并且细胞体积的微笑变化，体积表征相对细胞直径的表征更加明显。譬如，10um的细胞，直径变大了5%，由于图像法的分辨率差很难看出差异，但按体积计算，体积的增加能达到15.7%，加上Multisizer的DPP功能，可以实现所关注粒径范围最多400个粒径分析通道（如下图所示），真正实现高分辨地检测体积的变化。
3.2 CAR-T细胞的数量和活率监控
2019年在SCI Immunotherapy杂志发表了一篇重磅文章《TREM1/Dap12-based CAR-T cells show potent antitumor activity》中描述，体外培养扩增过程中，除了使用Multisizer来检测细胞体积外，细胞数量和活率的检测也一样重要。
不同处理得到的CAR-T细胞扩增速率也是不同的，我们可以通过扩增时间的比较来检查细胞生长状态的好坏，以此帮助分析得到合适的细胞培养条件和细胞处理方法。
另外，对于进入生产化的细胞产品，所有的分析仪器都需要合规，包括来自FDA 21CFR Part11和GMP生产要求，仪器操作要有多级管理权限，操作和报错都必须存有电子记录，Vi-CELL BLU对已经考虑到了这些生产质控的要求，所以分析软件都能符合这些规定。
CAR-T细胞免疫治疗的过程
CAR-T细胞免疫疗法在近几年来被越来越多大众所了解，也有大量的生物制药公司加入到CAR-T细胞免疫治疗的队伍，国外目前上市原研药还是诺华的Kymriah和被吉利德收购德Kite制药德Yescarta。而国内企业也在加紧研发和上市的步伐，其中复兴凯特和药明巨诺分别在今年的2月和6月递交了上市申请。如下是这几家公司CAR-T研发生产上市的进展表。其中，作为国内龙头之一的南京传奇也在全力地推动产品的商业化，预计下半年会在美国递交上市申请。
