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CAR-T生产工艺流程及优化考量(上)

发布时间:2020-08-11 13:13 信息来源: 阅读次数:

细胞毒性CD8+CART细胞,直接介导肿瘤细胞清除,但是CD4+辅助细胞(Th细胞)同样有着重要作用。CD4+和CD8+CART应该有一个合适的比例,有报道,治疗B-ALL中,1:1会获得产生更好的肿瘤消退疗效。



调节性T细胞浸润到实体肿瘤局部,会降低CD28-CD3ζ信号通路活性。去除CD28CAR胞内段的Lck结合结构域,即使在调节性T细胞存在的情况下,也有强抗肿瘤活性。

低分化的初始样T细胞naïve-like T cells ,TN cells,表型CD45RA+ CD45RO- CD95-,CCR7+,CD62L+,CD28+,CD27+)和干细胞记忆样T细胞Stem cell memory-like T cells ,TSCM cells,表型CD45RA+ CD45RO- CCR7+CD95+)具有更强的增殖能力和自我更新能力,以及分化为效应和记忆T细胞的能力,因而有产生更好临床结果的潜能,更持久的抗肿瘤活性。

而分化的效应样T细胞(T effector-like cells,TEff cells,表型CD45RA+ CCR7-)虽然体外表现初强的抗肿瘤活性,但是在体内,活化和增殖等能力均受损。

肿瘤高表达免疫检查点配体,免疫细胞高表达免疫检查点受体,则病人对于CART缺乏应答。

T细胞需要表达淋巴组织归巢分子CCR7和CD62L),有助于浸润到肿瘤局部,起到更好的治疗效果。如上文,TN和TSCM表达归巢受体,而Teff不表达归巢受体。高表达CXCR2GD2也有助于CAR-T浸润到肿瘤组织。


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1.  细胞分离和富集



分离方法:传统方法Ficoll密度梯度离心用于去除颗粒细胞、红细胞和血小板;自动化的分离系统:Sefia Cell Processing System,CliniMACS Prodigy。
基于CD3+进行细胞分选,然后以磁珠为基础的技术如CliniMACS Prodigy,使用anti-CD3,anti-CD4,anti-CD8磁珠分选或者去除特定的细胞群,以获得合理比例的CD4:CD8。

特定未分化的TN,TSCM,TCM细胞对于临床是有益的,但是分选流程复杂,在实际生产流程中有一定困难。


2.  T细胞激活



2.1anti-CD3/anti-CD28抗体活化
使用抗CD3(OKT-3单克隆抗体)/抗CD28抗体包被磁珠作为人工抗原提呈颗粒,anti-CD3提供增殖信号,anti-CD28提供共刺激信号。活化之后,磁珠可被磁铁去除掉。

和可溶性OKT-3抗体相比,抗体包被磁珠活化细胞,具有更少的分化,更少衰老的特点。另外富集和清洗细胞会更加简单,昂贵抗体的丢失更少。因而磁珠法是生产工艺中最常用的方法,如诺华的Kymriah。

最近一种特殊的聚合物纳米基体产品(T Cell TransAct),上面结合有人源化CD3和CD28抗体,结合使用无血清培养基(TexMACS),用于T细胞活化。这种方法增加了高表达CD62L,CCR7的 TCM细胞,减少CD57+耗竭T细胞,但是不改变PD-1的表达和基因转染效率,而且细胞裂解活性降低。

2.2 Retronectin
Retronectin是另外一种活化策略,使用重组纤维连接片段,同时可以增加逆转录病毒的感染效率。Retronectin和板结合CD3抗体,或者anti-CD3/anti-CD28磁珠,用于GD2特异性CART和CD19特异性CART,增加TN和TSCM的比例。但是T细胞活化弱,扩增弱,细胞因子分泌少等是缺点。

2.3 人工APC细胞

人工APC递呈TAA给CART,使其活化。比如使用K-562同时表达TAA和共刺激分子,不表达HLA-A,HLA-B,仅可用于TAA特异性CART活化。

3.  基因转导系统

3.1病毒转导

病毒转染系统转染效率高,最常用的是逆转录病毒载体和慢病毒载体。逆转录病毒将病毒DNA整合到宿主DNA中,产生稳定的转染。慢病毒需要调节基因来中和宿主细胞的防御,削弱免疫反应,以及调节病毒复制。慢病毒载体,插入诱变和致癌的风险很低。

逆转录病毒生产需要大量的包装细胞,而慢病毒载体生产需要大量质粒DAN进行瞬时转染。病毒的生产需要GMP级别的生产车间和一系列的检测方法,是病毒转染细胞最大瓶颈。

诺华的Kymriah® (Tisagenlecleucel)和 施贵宝Lisocabtagene maraleucel (liso-cel; JCAR017)均使用慢病毒载体。Kite Yescarta (axicabtagene ciloleucel) 使用逆转录病毒。

3.2 基于质粒的基因传递

转座子/转座酶系统是一种替代的非病毒基因传递策略。采用“睡美人”转座子/转座酶系统进行CART制造。该系统由两个DNA质粒组成,一个编码CAR,第二表达转座酶,这是切除和插入转基因所必需的。这种方法不需要GMP车间生产病毒,成本低。在第一代CART和第三代CART中被使用,产品已经开始在临床实验中使用。

3.3 基因编辑

CRISPR/Cas9能够特异性地破坏多个基因的基因组基因座。CRISPR/Cas9系统结合腺相关病毒(AAV)载体,将CAR的DNA整合入T细胞受体a,提高T细胞效力,抑制T细胞分化和衰竭。使用基因编辑和慢病毒转导,用于产生PD-1缺陷的CD19特异性CART,增强抗肿瘤活性。