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干货 | 外源性DNA残留检测简介

发布时间:2022-10-24 17:32 信息来源: 阅读次数:


外源性DNA属于生物制品工艺相关杂质,对其含量进行检测可以确认产品纯化工艺是否合理,即能否有效去除外源DNA残余;同时可确认产品中杂质含量是否符合标准要求,该检测值是生物制品质量控制的重要参数之一。


外源性DNA的来源



生产生物制品的宿主细胞(细菌、真菌和哺乳动物细胞)基因组,如E.coli、酿酒酵母、Vero细胞等;


生产用细胞携带的潜在病毒、包装用病毒基因组或相关特定转化序列,如逆转录病毒、辅助病毒、SV40大T抗原等;


质粒DNA,如包装质粒或体外转录模板。


外源性DNA残留的风险



感染性风险:整合的或游离的DNA病毒和反转录病毒的DNA在机体内外均具有感染性,感染后可产生感染性病毒粒子,其风险可能比致癌性风险更高。


致癌性风险:现存的主要致癌机制是引入的显性致癌基因(如真核生物中广泛存在的ras基因),通过直接转化使得部分正常细胞分化为瘤性细胞。


免疫原性风险:细菌基因组富含的CpG组分和未甲基化修饰的序列会刺激非特异性免疫反应,增加免疫原性风险。


致突变性风险:哺乳动物细胞基因组中含有高拷贝数的转座子,可通过异位重排改变基因组从而致突变。


外源性DNA残留的限定标准



中国药典》2020年版规定:细胞基质生产的生物制品DNA残留量不高于100 pg/剂、细菌或真菌基质生产的制剂DNA残留量不超过10 ng/剂;


美国药典:规定成品中残留DNA不高于10 ng/剂、长度不大于200 bp;


欧洲药典:规定残留DNA不超过10 ng/剂,具体可接受限度需由权威机构批准。

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后台回复“外源性DNA残留”,获取相关法规原件。


外源性DNA残留的检测方法



DNA 探针杂交法

根据检测目标DNA设计特异性探针,同位素或荧光染料标记后与固定在膜上的变性DNA样本杂交并显现斑点,通过与DNA标准品信号值对比来估算样本中DNA残留量。

该方法优势在于可通过电泳估计DNA分子大小,但缺点也很明显,即实验耗时长(48 h)。另外,若用同位素标记探针,灵敏度能达到pg级,但只能半定量检测且有放射性污染风险;荧光染料标记探针能对DNA残留进行定量检测,但灵敏度有所降低。


荧光染色法

应用荧光染料picogreen与双链DNA结合形成复合物,在480 nm激发光、520 nm接收光下检测,在一定的DNA浓度范围及荧光染料过量的条件下荧光强度与DNA浓度成正比,根据荧光强度计算样本中DNA残留量。

该方法操作简单、成本低廉、无需纯化DNA;纯DNA条件下灵敏度为0.2 ng/ml,基质中单链DNA和RNA对检测影响较小,高浓度蛋白对检测有干扰,故疫苗类产品经方法学验证后是可以使用的,但不适用于高剂量的蛋白类制品;该方法对各类DNA具有通用性,无需对不同类型DNA设计特异性探针,但也因其特异性差易受环境中DNA污染。


定量PCR法

对外源性DNA设计特异性引物和荧光标记的探针,以反应体系中荧光数值反映特异性扩增产物量,当反应过程中荧光强度达到预设的阈值时,体系的PCR循环数与该体系所含有的起始DNA模板量的对数呈线性关系,依据DNA标准品测定样本中外源性DNA残留量。

该方法序列特异性强、灵敏度高(fg级)、重现性好,是中国药典、美国药典和欧洲药典均推荐的方法;靶标区域的选择、引物和探针的特异性、DNA标准品质量对方法的灵敏度和准确度有较大影响,需针对不同外源性DNA开发特异的检测体系和DNA标准品。


免疫阈值法

应用单链DNA结合蛋白捕获变性的单链DNA,然后用尿素酶标记的抗-DNA抗体与结合的DNA反应,以尿素酶水解尿素后溶液pH变化反应体系中DNA含量,经DNA标准品计算残留DNA含量。

该方法灵敏度高(1-3 pg),有标准化操作流程,但依赖单链DNA结合蛋白和抗-DNA单克隆抗体两种蛋白与DNA的结合,费用较高且需片段不小于600 bp。


珈创生物致力于外源性DNA残留检测服务的开展,欢迎新老客户前来咨询。


参考文献:

Xing Wang,Donna M. Morgan,Gan Wang, Ned M. Mozier1.Residual DNA Analysis in Biologics Development: Review of Measurement and Quantitation Technologies and Future Directions.Biotecnology





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关于珈创生物

武汉珈创生物技术股份有限公司,创建于2011年,是一家集生物技术服务与研发为一体的高新技术企业,专注于为生物药品/制品的生产企业及研发机构提供各类细胞(含重组细胞、干细胞、免疫细胞等)及原辅料的质量检测、病毒清除工艺验证技术服务。






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