珈创生物 —— 生物技术服务与研发为一体的高新技术企业

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中国药典要求对细胞系进行检定,NMPA、FDA、EMA、世界卫生组织(WHO) 和人类用药注册技术要求协调国际会议(ICH)的各种法规文件概述了对细胞库检定的要求和指导,以确认细胞的起源和历史,并鉴定和测试细胞的身份,稳定性和纯度。

细胞检定主要包括几个方面:细胞鉴别、无菌检查、支原体检查、内外源病毒因子检查、成瘤性/致瘤性检查等。

这些检测项目对于 MCB 细胞和 WCB 细胞及生产限定代次细胞均适用。

我们建议在药物生产的各个阶段对哺乳动物和非哺乳动物细胞系进行检定,包括:

主细胞库(MCB) 工作细胞库(WCB) 生产终末细胞(EOPC) 病毒种子库(VSS) 原材料及最终产品

细胞系检测

细胞鉴别试验

新建细胞系/株、细胞库和生产终末细胞应进行鉴别试验,以确定为本细胞,且无其他细胞的交叉污染。珈创生物提供多种鉴别试验,客户可选择一种或多种方法对其细胞系/株进行种属鉴别。

染色体核型分析

核型分析的结果可以确认样品的细胞系身份和来源物种。我们拥有多种细胞(包括人源细胞,人源干细胞,猴 Vero,仓鼠 CHO)核型细胞分析的丰富经验。

染色体核型分析包括但不限于:中期染色体 G 显带分析和染色体计数(提供二倍体染色体数,频率分布和多倍体水平)。

同工酶试验

对细胞乳酸脱氢酶(LD)、6-磷酸葡萄糖脱氢酶(G6PD)和核苷磷酸化酶 (NP)三种酶分别进行凝胶电泳试验,并通过与指示细胞对比,确定有无交叉污染。

短串联重复序列分析(STR)

STR(短串联重复序列)分析法即通过提取样品 DNA,PCR 扩增 STR 位点, PCR 产物检测,检测结果分析,并与 ATCC 和 DSMZ 数据库进行比对,以确定样品种属来源,判断其是否存在其他人源细胞交叉污染。

无菌检查

参考中国药典通则 1101,提供符合法规要求的薄膜过滤法和直接接种法。无菌检查均在 A 级隔离器或 C+A 级环境中进行,且在检测过程中持续进行环境监测。

适用性检查:均可按照法规的要求,对不同的供试品进行适用性试验。 以确认所采用的方法适合供试品的无菌检查。

薄膜过滤法:采用封闭式薄膜过滤器,可过滤大量供试品以及利于解决供试品中可能存在微生物生长抑制剂等问题。是可过滤供试品首选的检测方法。

直接接种法:适用于无法用薄膜过滤法进行检测的供试品,包括混悬液等非澄清水溶液、固体供试品、非水溶性供试品和灭菌医疗器械等。

分枝杆菌检查

珈创生物参考中国药典通则 1101,采用 Middlebrook 7H10 平板培养法,提供符合法规要求的分枝杆菌检查。检查均在A级隔离器或C+A级环境中进行,且在检测过程中持续进行环境监测。

支原体检查

珈创生物参考中国药典通则 3301,提供符合法规要求的支原体检查包括培养法和指示细胞培养法(DNA 染色法)。

培养法:供试品分别接种固体和液体培养基,于接种一周后取液体培养基转种进行次代培养,观察初代培养和次代培养结果。

指示细胞培养法(DNA 染色法):供试品接种于对照细胞,培养 3-5 天后传代再培养 3-5 天,于培养期末进行染色观察。

内外源病毒污染检查

检查细胞系/株中是否有来源物种中潜在的可传染的病毒,以及由于使用的原 材料或操作带入的外源性病毒。细胞进行病毒检查的种类及方法,须根据细胞种属来源、组织来源、细胞特性、传代历史、培养方法及过程等确定。 在您开展检测前,珈创愿意与您进行充分的沟通,确定合适的检测方案。

细胞形态观察及血吸附试验

体外不同指示细胞接种培养法

动物体内接种法

乳鼠脑内及腹腔接种法

小鼠脑内及腹腔接种法

豚鼠腹腔接种法

家兔皮内及皮下接种法

鸡胚接种法

鸡胚卵黄囊接种法

鸡胚尿囊腔接种及尿囊液血凝试验

逆转录病毒检测

逆转录酶活性测定法 PERT

感染性试验

透射电镜观察法

种属特异性外源病毒因子检测

应根据细胞系/株种属来源、组织来源及供体健康状况等确定检测病毒的种类。

鼠源细胞系

鼠源病毒检查

人源细胞系/株

人源病毒检测Q-PCR法

牛源性病毒检测

细胞培养法

荧光抗体检测法

猪源性病毒检测

细胞培养法

普通PCR法

Q-PCR法

其他特定病毒检测

鼠细小病毒检测

细胞培养法

普通PCR法

Q-PCR法

杯状病毒(Vesivirus 2117)检测--Q- PCR法 CHO细胞系

成瘤性检查

动物体内接种法(裸鼠)

软琼脂克隆形成试验

干细胞等不同类别细胞治疗产品的生产过程都会涉及细胞的离体培养。而细胞离体培养必然会涉及生物学属性的变化、生物学安全性改变、外源性污染、交叉污染等问题,这些问题严重影响研发初始到生产过程的进展和成功。干细胞产品的多样性、复杂性对于其质量控制提出巨大的挑战。

干细胞的综合质量要求可归纳为基本生物学属性,微生物学安全性,生物学安全性及生物学有效性四大类,珈创生物期待与您进行充分的沟通,确定合适的干细胞质量控制方案。


基本生物学属性

细胞鉴别:

染色体核型分析

同工酶试验

短串联重复序列分析(STR)

细胞活性鉴别:

细胞计数和细胞存活率检测

细胞生长曲线测定

细胞周期测定--PI 染色法

微生物安全性评价

微生物安全性方面,包括各类干细胞在内的所有治疗性细胞产品需具备生产用细胞基质的微生物安全性。需要对相关细胞进行无菌,支原体,分枝杆菌,内外源特异或非特异性病毒,内毒素微生物代谢产物的检测。另外,在干细胞的获取,扩增,培养传代和冻存过程中,应对所使用材料相关的可能的动物源性微生物污染进行检测。

珈创可提供相应的检测服务,链接(细胞系检测原材料检测

生物安全性评价

干细胞的生物学安全性主要由其细胞生物学特性,细胞来源,制备工艺等相关风险因素决定,各种风险因素可导致细胞产品的异常免疫反应,致瘤性和/或促瘤性等,目前干细胞生物安全性评价以免疫学反应和致瘤性为主要内容。

成瘤性检查

端粒酶活性检查

免疫学反应检测

淋巴细胞增殖抑制试验

特定淋巴细胞亚群检测法(Th1,Th17,Treg)

淋巴细胞分泌 TNF-α抑制试验

生物学有效性检查

珈创生物对于 MSC 的生物学有效性可开展相应的检测服务。

生物学有效性评价

成骨细胞分化试验

成软骨细胞分化试验

成脂细胞分化试验


珈创生物在生物制品的质量控制领域不停探索,为您提供可靠的检测服务,新的检测服务持续开发中。

病毒种子批质量检测服务

生物制品生产用菌毒种应采用种子批系统,应进行生物学特性,生化特性等检测,珈创生物结合中国药典规定,为客户提供一定程度的病毒种子批和菌种检测服务。

病毒种子批检测服务

无菌检查

支原体检查

分枝杆菌检查

外源病毒因子检查

病毒滴度测定

菌种检测服务

原核或真核系统表达、生产生物制品,应对其重组菌(细菌、酵母菌)进行相应的鉴定和质量检测,符合相关规定方可使用。

菌种检测服务

菌株染色观察

普通染色

革兰氏染色

菌落形态观察

菌株抗生素抗性试验

菌株生化特征分析--生化反应试验

菌种检查--核酸序列测序分析

噬菌体污染检查

透射电镜观察--负染色法析

培养观察--噬斑法

原材料检测服务

对于不同风险级别原材料的质量控制,应充分考虑来源于动物(或人)的生物原材料可能带来的外源因子污染的安全风险。

根据原材料的来源、生产以及对生物制品潜在的毒性和外源因子污染风险等将生物制品生产用原材料按风险等级别划分,对于不同风险级别原材料,应充分考虑可能带来的外源因子污染的安全性风险进行检测。

珈创生物能够针对性的对生产过程中所用的原料进行检定,通过无菌,支原体,病毒外源因子,内毒素等检测,来证明生产过程的细胞培养成分,添加物和胰酶等的质量。基因治疗药物生产过程中的质粒 DNA 也可进行相应的检定。


无菌检查

支原体检查

外源因子检测

动物来源原材料牛源病毒测试

动物来源原材料猪源病毒测试

动物来源原材料鼠源病毒测试

内毒素检测





无论是原核或真核系统表达、生产生物制品,都存在不同程度的残留物于产品中,因此,残留物的检测是必需的,否则严重影响产品质量。

如:牛血清白蛋白(Bovine serum albumin,BSA)是胎牛血清中的主要成分,广泛应用在抗体药物、疫苗药物以及CGT药物等生物制品的生产过程中。对于疫苗类药物,目前很多病毒性疫苗产品(如狂犬、麻疹、腮腺炎、风疹、水痘疫苗等)是采用细胞培养法生产的,因此牛血清白蛋白(BSA)残留量的检测是疫苗产品中重要的质控指标,直接关系到疫苗使用的安全性。

如:抗生素残留对人体健康有着十分严重的危害,包括“三致”(致癌、致畸、致突变)作用、人体对此类药物的长期暴露,通常不会造成急性中毒,而主要是引起慢性中毒。

抗生素不是疫苗中的必须成分,但在一些疫苗的制备过程中,为了防止细菌污染,所以要添加一些抗生素。在最终成品前,还要尽量去除抗生素。

《中国药典 2020版 三部》中各种疫苗药物的BSA的残留量都进行了明确规定:原液应不高于50ng/ml(除甲型肝炎灭活疫苗),成品应不高于50ng/剂。


我司参照以上法规要求,搭建了相应的残留物检测技术体系,具体项目如以下表格:

表 1 原材料检定项目汇总表


序号

类别(产品/项目/参数)

产品/项目/参数

参考法规


序号 名称
1

残留物检测


1.1

牛血清白蛋白残留检测法

《中国药典 2020版 三部》各论、通则3407 /3408/ 3411

1.2

抗生素残留检测--培养法

(含青霉素、链霉素)

1.3

CHO细胞DNA残留检测法



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在慢病毒载体的生产过程中,因穿梭载体、包装载体及包装细胞中的内源性逆转录元件之间,或病毒载体与细胞的内源性逆转录元件之间发生重组可能产生具有复制能力的慢病毒,即复制型慢病毒(replication competent lentivirus, RCL)。鉴于RCL潜在的威胁,FDA及欧盟先后出台了相关文件,要求在在生产及应用的不同阶段进行RCR/RCL的控制,包括生产病毒的细胞库、终末细胞、病毒载体及转导细胞,并对CAR-T细胞回输后的患者个体进行监测。


敏感细胞共培养测定法

将可能存在RCL风险的样品在敏感细胞上扩增,并在指示终点利用敏感、快速的检测方法(ELISA p24蛋白测定法、Q-PCR法、产物增强性逆转录酶活性检测法(PERT))进行检测。

构建HIV-1弱毒株作为RCL实验的阳性对照病毒,设置阴性对照、阳性对照和抑制对照,验证反应体系的适用性,监测反应灵敏度。

RCL检测方法已经过方法验证,可满足不同类型供试品的检测需求。


主要法规依据

《CAR-T细胞治疗产品质量控制检测研究及非临床研究考虑要点》,中国食品药品检定研究院,2018

《体外基因修饰系统药学研究与评价技术指导原则(试行)》,国家药品监督管理局药品审评中心,2022

《免疫细胞治疗产品药学研究与评价技术指导原则(试行)》,国家药品监督管理局药品审评中心,2022

Guidance for Industry: Testing of Retroviral Vector-Based Human Gene Therapy Products for Replication Competent Retrovirus During Product Manufacture and Patient Follow-up ,FDA,2020

Guidance for Industry: Chemistry, Manufacturing, and Control (CMC) Information for Human Gene Therapy Investigational New Drug Applications (INDs) ,FDA,2020

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